Posta in bella posizione sulle colline di Arcetri, la villa fu costruita nella prima metà del XV secolo a opera della famiglia Masi. La sua proprietà cambiò diverse volte nel corso dei due secoli successivi (fu anche residenza di campagna dei Cavalcanti), finché nel 1631 Galileo Galilei la prese in affitto dalla famiglia Martellini su suggerimento della figlia Virginia, monaca del vicinissimo monastero di San Matteo. Galileo visse quasi ininterrottamente nella villa fino alla morte (1642) e in particolare, dopo il famoso processo del 1633, essa rappresentò anche la dimora coatta dello scienziato, obbligato dal Sant’Uffizio a vivere praticamente recluso nell’abitazione e sotto la severa proibizione di conversare con altri uomini di scienza e soprattutto di parlare in qualunque occasione delle teorie eliocentriche copernicane. Nonostante ciò, la casa di Arcetri fu un’intensa fucina di produzione letteraria (Galileo vi scrisse i Discorsi e dimostrazioni matematiche intorno a due nuove scienze, opera di capitale importanza nella diffusione di un nuovo modello di scrittura scientifica in italiano) e di rapporti intellettuali, come quelli con gli scienziati Evangelista Torricelli e Vincenzo Viviani, con il poeta inglese John Milton, che fece visita a Galileo nel 1638, e con il pittore fiammingo Jost Sustermans, che proprio nella villa dipinse il più famoso dei ritratti di Galileo (1638).